中药材真伪鉴别新方法——DNA分子标记鉴别技术

【天地网讯】　中药品种繁多，应用历史悠久，产区广泛。由于地理和历史的原因，药材品种混乱，基源复杂，如仅《中华人民共和国药典》2000年版收载的534种中药材，即有143种为多基源(二基源以上)，占收载总数的27%。加之中药的同名异物或同物异名现象普遍存在以及伪品、混淆品和误用品等因素，对中药的化学成分和药理作用的研究、制剂生产、临床疗效及推广使用等都有直接影响，严重影响了中医药的信誉。同时，即使是同种药材，由于产地不同、野生与栽培以及生长年限不同都表现出质量和疗效上的差异，这些问题为中药材鉴别方法提出了新的挑战，依赖经典形态分类以及传统鉴别方法已无法满足鉴别的需要。随着各种先进仪器以及分子生物学的发展，各种新的鉴别方法亦纷纷推出，如红外光谱鉴别、化学指纹图谱鉴别以及DNA分子标记鉴别等，中药材鉴别领域显示出了蓬勃的生机。
　　近年来，以PCR为基础的DNA分子标记鉴别技术在中药材真伪鉴别中发挥了重要的作用，同时，在多基源品种的鉴别及道地药材鉴别中也崭露头角，显示出了巨大的前景。以人参、西洋参的分子标记鉴别研究为例，可以清楚地看出中药材分子标记鉴别的研究轨迹。从1994年AP-PCR首次用于人参、西洋参的鉴别以来，已有24篇相关的报道，按照所用方法的不同可分为三种：①基于PCR技术的方法有18篇文献，其中利用随机引物如RAPD和Ap-PCR等的有9篇，利用特异引物如MARMS、SCAR等的3篇，AFLP的3篇，PCR-RFLP的3篇；②利用DNA测序技术的有7篇；③基于分子杂交的方法有1篇，主要针对重复序列。有的报道中同时使用两种方法，如同时使用ITS序列分析与RAPD、PCR—RFLP和RAPD等。根据各个文献发表时间及其使用的方法可以得到人参类药材分子鉴定的发展特点：①随机引物虽占据主导地位，但随着时间的推移，RAPD等方法逐渐推出舞台。无须预先知道基因组信息的特点，使RAPD在中药材分子鉴定上成为最主要的方法，但随着18S、matK基因的测序，新方法便得以诞生，如MARMS。同时，在RAPD基础上发展起来的方法也显示了极好的应用前景，如SCAR标记以及应用梯度PCR检测中药复方中人参的PCR引物均是从RAPD的特异条带中得到的。②序列分析是各种新方法应用的基础。植物核基因组中的rDNA是研究最为广泛的基因之一，其中18S、ITS以及5S已成功的应用与人参西洋参的鉴别，可以直接利用测序后的碱基变异作为鉴别指标也可以利用等位基因PCR直接检测变异位点，从而通过电泳就可达到准确的鉴别。等位基因PCR简单、快捷、目标明确，有非常大的推广应用价值。此外，叶绿体基因中的编码间隔区正逐渐成为分子系统学研究的热点，如参类药材对叶绿体基因中的matK以及trnC-trnD进行了测序。③简单、快捷、准确是分子鉴定发展的趋势。参类药材分子鉴定的历程基本是随机引物—序列分析—PCR-RFLP—AFLP—特异引物PCR，体现了由复杂向简单的过程。近两年来，特异引物的应用以及在复方中参类药材的成功检出，标志着参类药材的鉴定达到了十分完美的地步。但这些仅仅解决了药材的“真伪”问题，质量的“优劣”却仍然没有很好的方法，如山参与栽培人参、朝鲜人参与中国人参、美国西洋参与中国引种栽培西洋参的鉴别为我们提出了新的课题。
　　针对以上问题，可以在以下几方面加强研究，以期达到“真伪优劣”鉴别的最终目标。
　　一、寻找进化速率快、种间高度变异的DNA序列进行测序分析。如叶绿体基因间隔区trnD-trnT，rpoB-trnC、trnH-psbA等。品种特征DNA序列的获得是将其转化为简易、高效的PCR鉴别以及高通量芯片鉴别的基础，同时大量序列的获得，也为中药材比较基因组学的研究提供了可能和基础。
　　二、大力开发新型实用的中药材分子标记鉴别方法和试剂盒。中药材DNA降解严重，合适的DNA提取和鉴别方法的选择是保证中药材分子标记鉴别成功的基础。因此，对已有的各种新型技术和方法，要进行筛选和改进以适于中药材鉴别的需要。
　　三、积极与其他技术和方法联用。不同的方法均存在一定的适用范围和局限性，如由于DNA分子标记不受生物体发育阶段的影响，无法鉴别不同生长年限的药材，对同基源（基因型）的野生与栽培药材的鉴别也存在一定困难，单一的DNA分子标记鉴别无法解决中药材鉴别的所有难题。因此，积极寻找与各种新型方法技术的有机联用，将可能为中药材鉴别提供崭新的空间。如目前飞速发展的代谢组学研究为中药材代谢标识物鉴别提供了可能，高通量、高灵敏度的GC-TofMS和QTofMS等仪器能同时观察上千个化合物，监测接近全景代谢物的变化，该方法不仅能观测到主要活性化合物，还能检测到代谢中间产物（包括非活性物质）的变化，不仅能反映植物基因型的差异，也能反映环境因素的作用。整合DNA分子标记与代谢标识物的“双标记”方法，将有利于建立与药材品质紧密连锁的特异、高效的标记平台，为中药材鉴别和质量控制提供新的方法和技术。