刘仪伟带领吃货挺进大别山 茯苓不同产地含量评测

　　金秋十月，无限极举办的2016“道地原料溯源之旅”启程。著名主持、国民美食家刘仪伟率养生文化爱好者、中医药行业专家等代表组成的百人“溯源之旅”探秘团，挺进大别山，踏上安徽岳西这片种植茯苓的优质地段，亲手采挖、辨识茯苓，品尝茯苓养生美食……亲身探寻道地茯苓产地的多重乐趣。不过，茯苓产地绝不局限于安徽岳西一地，茯苓产地分布较广，不同产地的茯苓各种成分有何差异?且听下面分解。

　　茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，根据临床用药及加工商品规格，茯苓可分为四种不同的药用部位。依据传统中医药理论及茯苓的传统加工方法，将新鲜茯苓个经发汗或冷冻后削下的黑色外皮称“茯苓皮”，利水消肿功效最佳;茯苓皮层以下的带色部分，削下切片干燥即为“赤茯苓”，长于渗利湿热;菌核内部白色部分切薄片或小方块、丁，即为“白茯苓”，擅长健脾益气;茯苓药材中带有松根的部分，即为“茯神”，茯神宁心安神功效最强。茯苓药材中化学成分主要包括多糖和茯苓酸，本文就根据不同产地分析这两种含量。

　　不同产地茯苓多糖含量评测

　　茯苓中β-茯苓聚糖占茯苓药材重量的90%以上。茯苓聚糖是一种水不溶性多糖，水解以后生成茯苓多糖及其衍生物才具有调节免疫、抗肿瘤等药理活性，水溶性多糖少于0.3%，因此，茯苓多糖含量测定主要是测定β- 茯苓聚糖的含量。

　　目前，茯苓加工以手工为主，加工工艺较为落后，茯苓药材质量差别很大，加工的商品规格有几十种，没有统一标准。茯苓皮临床用量不大，没有得到大量的综合开发利用，大部分作为废料处理，造成极大浪费。本研究采用紫外分光光度法，对茯苓不同产地、茯苓药用部位多糖含量进行比较，从而为茯苓药材质量和商品规格等级制订提供科学依据。

　　分别取不同量已知含量的茯苓药材粉末(过80 目筛)6 份，精密称定，置圆底烧瓶中，分别用150mL 80%乙醇回流提取1h，趁热过滤，残渣用80%的热乙醇洗涤2次，每次10mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，分别精密加入不同量的葡萄糖对照品，精密加入1mol·L^-1 NaOH 溶液150mL，瓶用热水洗涤2次，每次10mL，合并滤液与洗液，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。

　　分别精密吸取供试液0.5mL 于25mL具塞试管中，加水至2.5mL，加入5.0%苯酚水溶液6.0mL，在冰水浴中缓缓加入浓硫酸至刻度，摇匀，放冷后置沸水浴中10min，取出，立即置冰水浴中冷却10min，取出，放置至室温，随行溶剂空白，测定吸收度。结果见表1。

表1 样品回收率试验结果

　　样品含量测定分别取不同产地茯苓不同部位药材粉末(过80目筛)约0.1g，精密称定，按方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试液0.5mL 于25mL具塞试管中，加水至2.5mL，加入5.0%苯酚水溶液6.0mL，在冰水浴中缓缓加入浓硫酸至刻度，摇匀，放冷后置沸水浴中10min，取出，立即置冰水浴中冷却10min，取出，放置至室温，随行溶剂空白，测定吸收度。结果见表2。

表2 多糖含量测定结果（n＝3）

　　同药用部位，通过对比全国八个主要茯苓产区茯苓不同药用部位碱溶性多糖含量测定结果，发现绝大部分产地茯苓药材，白茯苓碱溶性多糖含量均在75%以上，赤茯苓、茯苓皮碱溶性多糖变化较大，茯苓皮碱溶性多糖含量在45%以上，仅比赤茯苓的碱溶性多糖含量低一些，当作废品丢弃可惜，应该综合考虑。

　　浸提溶剂的考察称定2.00g合欢花粉末两份，分别用40mL的水和60%乙醇做溶剂，于70 ℃水浴上加热回流2h，浸提2次，合并滤液，制成供试品溶液，按操作，计算黄酮得率。结果显示水提法黄酮平均得率为0.13% (n=3)，远低于醇提法，并且水提法得到的样品溶液较为浑浊，影响测定结果。故而选择醇提法作为浸提黄酮的方法。

　　浸提次数的考察称取合欢花粉末2.00g三份分别置于烧瓶中，加入40m 的60%乙醇，于70 ℃的水浴上回流2 h，分别浸提1次、2次、3次，浸提液抽滤，合并滤液，制成供试品溶液，按操作，计算黄酮得率结果显示黄酮得率分别为1.59% 、2.31% 、2.38% (n=3)。黄酮得率随着浸提次数的增加而增大，但第二次浸提和第三次浸提差别不大，说明合欢花经过2次浸提，其所含的黄酮大部分被提出来了，若再提1次，黄酮得率仅稍稍提高，而溶剂消耗增加，增加了过滤浓缩等后续工作量，使成本升高，故合欢花黄酮浸提两次比较适宜。

　　安徽省大别山所产茯苓药材白茯苓碱溶性多糖含量较其他产地高，同省不同产地白茯苓碱溶性多糖含量有明显差异，说明茯苓药材中白茯苓碱溶性多糖含量区域性较强，主要原因是安徽省大别山为白色砂性土，土壤含砂很大;所产茯苓质地洁白、致密、纯净，不易浸染、腐烂、串色，颜色越深，质地越松泡，腐烂、浸染，茯苓药材中碱溶性多糖含量越低。茯苓不同药用部位茯苓多糖含量比较，结果显示白茯苓> 赤茯苓> 茯苓皮，并发现茯苓颜色越深，质地越松泡，腐烂、浸染，茯苓药材中碱溶性多糖含量越低，这为临床用药和茯苓加工商品规格制订和加工方法提供了科学依据。

　　茯神采样困难，笔者只收集到湖南和安徽的茯神，通过研究，结果显示茯神多糖含量低于白茯苓，略高于赤茯苓(数据略)，推测认为茯神中白茯苓所占比例相对较少，赤茯苓和茯神木占有一定的比例，有很少一部分出现浸染、腐烂、串色。分别采用冷浸提取法、温浸提取法、超声提取法、回流提取法进行比较，结果发现，冷浸提取法>超声提取法> 温浸提取法> 回流提取法，温度对茯苓多糖提取有较大的影响，低温能有效增加茯苓多糖提取率，碱性条件下高温对茯苓多糖有破坏作用，一部分多糖变成了小分子化合物，不能与苯酚- 硫酸溶液显色，因此本试验采用低温冷浸法提取茯苓多糖。

　　通过对比苯酚- 硫酸法和蒽酮- 硫酸法，发现采用蒽酮- 硫酸法，加热时间对最大吸收峰有较大影响，稳定性差，这与参考文献结论一致。苯酚- 硫酸法利用多糖类成分在硫酸作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚溶合成有色的化合物，且颜色稳定，此溶液在适当波长(489nm)有特征吸收，作为测定茯苓多糖含量的方法，结果准确，稳定性、重现性好。

　　综上所述，采用苯酚- 硫酸法测定茯苓不同产地、不同药用部位多糖含量，方法稳定可行，可用于茯苓药材质量评价。由于茯苓不同药用部位成分含量存在差异，并与临床疗效密切相关。因此，规范茯苓不同药用部位和加工方法，制定茯苓药材加工商品等级的质量标准，并与三萜类成分含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物一起，共同准确评价茯苓药材质量优劣，建立茯苓药材质量标准具有重要意义。

　　不同产地茯苓酸含量差异评测

　　中茯苓酸是其主要有效成分之一。2015年版《中华人民共和国药典》(一部)未收载茯苓的含量测定项。本试验采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对茯苓中茯苓酸进行了含量分析,建立了简便快捷、准确可靠的含量测定方法,进一步完善了茯苓药材的质量控制标准。

　　茯苓药材由本课题组分别采自湖南、河南、四川、浙江、贵州、安徽、湖北、广州、福建9个地区,共9批。

　　精密称取茯苓粗粉(过60目筛)约1.0g,置于50 mL 具塞锥型瓶中,加甲醇30 mL,加塞称定,浸泡30 min,超声90 min,途中及结束时用甲醇补足减失的重量,冷却,过滤;用甲醇洗涤滤渣,洗液合并于滤液中,置蒸发皿中水浴蒸干,残留物用甲醇定容至10mL 容量瓶中,即得。

　　精密称取已知含量的样品0.5g,共6份,分别加入一定量的茯苓酸对照品，按下方法制备并测定量,RSD=1.85%(n =6),结果见表3。

表3 加样回收试验结果

　　取不同产地茯苓粗粉,按方法制备供试品溶液,用0.45μm 微孔滤膜过滤,滤液密封备用。分别精密吸取各供试品溶液10μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,并计算样品溶液中茯苓酸的含量。结果显示,四川西昌和湖北罗田产茯苓中茯苓酸的含量明显高于其他产地,结果见表4。

表4 各产地茯苓中茯苓酸的含量测定结果

　　经反复试验,建立了茯苓药材主要有效成分茯苓酸的含量测定方法,该方法重复性好,可靠性强,完善了2015 年版《中华人民共和国药典》(一部)収载茯苓药材的质量标准,为再版药典补充茯苓药材质量标准“含量测定”内容提供了依据。这对于进一步有效控制茯苓药材的质量具有重要意义。9个产地所产茯苓中茯苓酸的含量测定表明,不同产地茯苓中茯苓酸含量有较大差异,四川西昌和湖北罗田产茯苓中茯苓酸的含量明显高于其他产地,表明其质量品质较优。这可能与繁殖菌种和生态环境有关,值得进一步深入研究。