玉竹提取物A对1型糖尿病小鼠血糖及细胞因子的调控作用

【天地网讯】    1型糖尿病（diabetes mellitus，DM）是胰岛β细胞进行性损害和胰岛素分泌不足的自身免疫性疾病，其详细的发病机理尚未完全阐明。一般认为其发病除了与遗传因素、环境因素有关外，免疫应答是启动因素，表现为细胞免疫和体液免疫均有异常，而细胞因子在此过程中可能起着主导作用［1,2］。
    玉竹（Polygonatum Odoratum （Mill.）Druce）为百合科黄精属中草药，含有多糖、生物碱、甾体皂甙等。玉竹的干燥根茎，性平、味甘，具养阴、润燥、除烦、生津止渴等功效,有强心、扩张血管、降血糖、降血脂、和抗肿瘤等作用［3~5］。本实验所采用的玉竹提取物A（extraction A of polygonatum odoratum, EAPAOA）是玉竹的干燥根茎经水醇法（30%乙醇）提取而得，通过观察它对STZ小鼠血糖血清IL4、IL10、IFNγ水平的影响，旨在探讨EAPAOA对STZ小鼠血糖和细胞因子的调控作用。
　　1 材料和方法
　　11 材料
　　111 实验动物
　　昆明小鼠60只，雌雄各半，体重18~20g ；C57BL小鼠50只，雄性，体重18~20g,购自中国医科大学实验动物中心。
　　112 主要试剂
　　EAPAOA：玉竹产自锦州凌海市温滴楼乡，将2.5Kg玉竹干燥根茎洗净、去须根、切碎，30%乙醇浸提，G4过滤分离，旋转蒸发仪蒸发回收乙醇，得黄棕色沉淀烘箱干燥后成780g浸膏备用，使用前分别配制成所需浓度的溶液，高压灭菌。STZ（美国sigma公司）；小鼠IL4、IFNγ试剂盒（进口分装，北京晶美公司）；小鼠IL10试剂盒（原装进口，美国Bender MedSystems公司）；血糖试纸（美国强生公司）；尿糖试纸（广州越秀东方新科技研究所研制生产）。
　　113 主要仪器
　　血糖仪（OneTouchI型血糖仪，美国强生公司）；酶标仪（DG3022A型，上海）。
　　12 实验方法
　　121 急性毒性试验
　　60只重约18~20g的健康昆明小鼠(雌雄各半)随机分成6组，每组10只，每只腹腔注射相应剂量的EAPAOA 0.5ml。一次性给药后即刻观察中毒症状并记录死亡动物只数。
　　122 实验动物分组及动物模型制备
　　将50只C57BL小鼠随机分为5组，其中实验组分为3个剂量组，以近似LD50 1/15剂量的1g/Kg作为基础给药量，另取其2倍、4倍量，即：1g/Kg(EAPAOA1组)、2g/Kg（EAPAOA2组）、4g/Kg（EAPAOA3组）；设正常对照组（control）和糖尿病对照组(DM)，每组10只。应用0.1mol/l枸橼酸钠缓冲液（pH4.4）配制成0.4％STZ溶液，按40mg/Kg剂量腹腔注射，每天1次，连续5天，每周分别测血糖、尿糖1次，动态监测1型DM模型的形成，除正常对照组小鼠外（只注射等体积枸橼酸钠缓冲液），其余组制备1型DM模型，以血糖≥11.4mmol/l，尿糖 以上2周，为模型制做成功［6］。低于此值弃去。小鼠自由饮食、饮水，不限量、标准饲料（锦州医学院实验动物中心提供）。正常对照组与DM对照组，腹腔注射生理盐水0.5ml，每日1次，共4周；EAPAOA1组EAPAOA 1g/Kg、EAPAOA2组EAPAOA 2g/Kg、EAPAOA3组EAPAOA 4g/Kg，分别以等体积0.5ml腹腔注射，每日1次，共4周。
　　123 血糖、尿糖测定
　　空腹血糖测试采用末梢全血快速血糖测定法，剪尾取血，血糖仪检测。尿糖水平采用广州越秀东方新科技研究所研制生产的尿糖试纸检测。用药前及用药过程中每周检测一次，共4周。
　　124 细胞因子检测
　　小鼠死前用摘眼球法取血，4℃离心分离血清，分装成100μl置-20℃保存。采用ELISA试剂盒，操作方法按试剂盒说明进行。全部标本同批测定。
　　125 统计学处理
　　采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，实验数据均以±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为差异非常显著。
　　2 实验结果
　　21 小鼠急性毒性试验结果
　　根据预实验结果决定剂量范围11.1734，12.4897，13.9609，15.6055，17.4439，19.5g・Kg-1，剂距为1.1178。雌雄小鼠在注射EAPAOA后，均出现四肢伏地、蜷缩，高剂量出现跳跃、死亡。19.5g・Kg-1组小鼠约10min死亡；17.4439g・Kg-1组小鼠约25min死亡，存活2只；15.6055g・Kg-1组小鼠约60min后有6只死亡；13.9609g・Kg-1组小鼠死亡5只； 12.4897g・Kg-1组小鼠死亡2只；11.1734g・Kg-1组小鼠死亡1只。存活小鼠约2ｈ后有恢复，但活动减少，4ｈ后开始进食。7ｄ后解剖观察到内脏器官无异常。用寇氏法计算LD50为14.5124g・Kg-1，95%可信限为13.5642～15.4606g・Kg-1。
　　22 模型制备
　　STZ溶液腹腔注射,每天一次,连续注射5天后,小鼠血糖呈持续上升趋势,在注射后15天至20天,血糖达到高峰状态,以后稍有一定幅度的下降,但一直稳定在较高水平。第2周开始,1/3模型鼠尿糖出现 、 不等，到第4周,90%小鼠尿糖出现 。各组1型DM小鼠随着血糖,尿糖水平上升,出现饮食、饮水量增多改变。
　　23 血糖测定
　　用药前DM对照组小鼠空腹血糖水平与实验组无显著性差异；用药后DM对照组小鼠空腹血糖水平明显高于EAPAOA各组；用药后1周 EAPAOA1组与DM对照组比较P<0.05，2~4周 P<0.01；EAPAOA2组、3组与DM对照组比较均P<0.01；EAPAOA1组与EAPAOA2组、3组比较P<0.01；EAPAOA2组与EAPAOA3组比较，无明显差异（P>0.05）。见表1。
　　24 血清IL4、IL10、IFNγ水平
　　ELISA法测定各组小鼠血清IL4、IL10、IFNγ水平结果显示，与正常对照组比较，DM对照组IFNγ水平明显升高，IL4、IL10水平明显降低；与DM对照组比较EAPAOA各组IFNγ水平有不同程度的降低，IL4、IL10水平有不同程度升高，接近甚至超过正常水平，EAPAOA1组差异显著（P<0.05）；EAPAOA2组、3组差异非常显著（P<0.01）；实验组组间比较，EAPAOA1组与2组、3组比较P<0.01；2组与3组比较P<0.05。见表2。表1 EAPAOA对STZ小鼠血糖的影响 (略)注：与DM对照组比较，* P<0.05， **P<0.01；EAPAOA2、3组与 EAPAOA1比较，△P<0.01。表2 EAPAOA对STZ小鼠血清IL4、IL10、IFNγ水平影响(略) 注：与DM对照组比较，* P<0.05, **P<0.01；EAPAOA2、3组与 EAPAOA1比较，△P<0.01；EAPAOA2与3组比较，#P<0.05。
　　3 讨论
　　许多证据支持１型糖尿病是一种因免疫调节机制紊乱所导致的自身免疫性疾病，研究发现1型DM的发生、进展由Th1／Th2型自身反应性T细胞之间平衡情况所决定。Th1细胞促进1型DM的发生、发展，而Th2细胞则起保护作用［7］。Th1分泌IFNγ，对 Th0向Th2分化有抑制作用，而Th2分泌的IL4、IL10，增强Th2抑制Th1的生成，Th1是Th2的抑制细胞，反之亦然。它们在免疫调节中互相拮抗，起着十分微妙的作用。
　　链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）是一种含亚硝基化合物，能特异性破坏胰岛β细胞，机制之一是通过诱导NO的合成增加对胰岛β细胞的氧化侵袭，与1型DM 病人发病时体内氧化侵袭增加相类似。小剂量多次注射STZ诱导糖尿病模型可有效的模拟1型DM病程及发病机理，适用于1型DM发病机理的研究［8,9］。
　　本研究成功建立STZ小剂量多次注射诱导1型糖尿病动物模型，结果表明DM对照组与正常对照组比较IFNγ水平明显升高，IL4、IL10水平明显降低，这与以往的大量报道相符合［10,11］，进一步证实了1型DM的发生与细胞因子密切相关。
　　研究发现，EAPAOA腹腔注射可降低STZ小鼠血糖。上调外周血IL4、IL10的表达，下调IFNγ的表达。因而提示EAPAOA对STZ小鼠的降糖作用与调节细胞因子比例失衡，纠正免疫失控状态，调节Th0、 Th1细胞向Th2转化有关。从而使Th1细胞介导的胰岛炎和β细胞损伤过程减轻或中断。通过免疫干预降低血糖，起到治疗作用。
　　实验发现，不同剂量EAPAOA 治疗效果不同。本实验通过EAPAOA三个剂量组对STZ小鼠免疫干预作用的对比观察，不论是血糖，还是血清细胞因子含量EAPAOA2组、3组，即2g/Kg、4g/Kg，效果均优于1g/Kg组（P<0.01）。2g/Kg组与4g/Kg组比较血糖值无显著性差异，血清细胞因子含量上却有显著性差异，4g/Kg组优于2g/Kg组（P<0.05）。因而提示，随着药物剂量的增加，药效也随之显著，免疫系统对此比较敏感，首先体现出来。如增大用药剂量或长期用药是否能在分子免疫学水平得到改善的基础上，使细胞与组织损伤程度上得到彻底改善，有待进一步研究。
　　目前DM已成为一种发病率高且呈逐年上升趋势的常见病。1型糖尿病占糖尿病患者总数5％～10％，全国1型DM总数至少100万，其中多数为儿童及青少年患者。他们需要依靠外源胰岛素存活，造成无数家庭精神上和经济上的巨大压力。EAPAOA急性毒性实验结果显示，LD50=14.5124 g・Kg-1是本实验有效剂量的14.5倍，显效剂量的3.6倍，安全性大，加之天然性、来源广泛、制备方便，有望成为1型DM免疫干预的新型防治措施。对其药物成分、用药剂量、降糖机制还有待进一步研究。（金艳书 庄晓燕　吴学敏 李宏伟　刘运芝）